細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時(shí)，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國(guó)產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來(lái)讓每一個(gè)和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國(guó)生物制造企業(yè)，圓夢(mèng)中國(guó)。

產(chǎn)品詳情

 產(chǎn)品描述

漿核蛋白的分離提取屬于生物學(xué)研究的重要實(shí)驗(yàn)之一，對(duì)于探究細(xì)胞中的不同組分以及蛋白在細(xì)胞中的定位具有重要的意義，促進(jìn)亞細(xì)胞蛋白組學(xué)發(fā)展，提取的核蛋白可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面研究，例如Pull Down，EMSA，footprinting等，為分子機(jī)制深入探索提供可靠技術(shù)支持。

基本原理如下：細(xì)胞在低滲條件下胞膜會(huì)發(fā)生脹破，釋放漿蛋白，離心得到細(xì)胞核沉淀，最后利用高鹽溶液抽提得到核蛋白，本試劑盒利用該原理，優(yōu)化配方組分和提取方法提供了一種高效提取漿核蛋白的方法，較大保持蛋白的天然活性，同時(shí)漿蛋白與核蛋白之間存在極少的交叉污染，為后續(xù)研究提供可靠的樣本。本試劑盒只適用于細(xì)胞樣品的核漿蛋白提取，每T約適用于約一個(gè)大皿細(xì)胞量的提取。

產(chǎn)品組成

運(yùn)輸與保存

-20℃保存，一年有效

實(shí)驗(yàn)步驟

1.試劑準(zhǔn)備：

室溫溶解試劑盒中三種組分，溶解后混勻冰上放置備用

（1）自備100 mM PMSF母液；

（2）漿蛋白抽提工作液：用細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A將試劑C稀釋至1X用，臨用前加入PMSF母液使其終濃度為1mM（現(xiàn)配現(xiàn)用）；

（3）核蛋白抽提工作液：用細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B將試劑C稀釋至1X用，臨用前加入PMSF母液使其終濃度為1mM（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2. 收集細(xì)胞沉淀

①對(duì)于貼壁細(xì)胞：棄去原來(lái)培養(yǎng)基，PBS清洗一遍，用細(xì)胞刮或消化收集細(xì)胞沉淀，盡可能吸凈上清，留下沉淀備用（推薦使EDTA溶液代替胰酶消化，以免胰酶殘留降解目的蛋白；每個(gè)樣品可用小離心機(jī)或原來(lái)離心機(jī)進(jìn)行二次離心，充分棄去殘留上清以保證后續(xù)提取效果不受影響）；②對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，PBS清洗一遍，盡可能吸凈上清，留下沉淀備用。

3. 漿蛋白的提取

（1）約50 μL體積的細(xì)胞沉淀中加入200 μL細(xì)胞漿蛋白抽提工作液，反復(fù)吹打混勻十多次至沉淀散離，冰浴10 min后再次吹打混勻十多次，繼續(xù)冰浴裂解5 min。

（2）高速劇烈渦旋5s，4℃ 600g離心5 min，此時(shí)得到的沉淀為細(xì)胞核沉淀，上清為粗提的漿蛋白，將此上清再次4℃ 12000g離心10 min去除雜質(zhì)即得到純凈的細(xì)胞漿蛋白。

4.核蛋白的提取

（1） 對(duì)于步驟3-(2)中獲得的細(xì)胞核沉淀加入400 μL細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A（此時(shí)使用的試劑A不含試劑C），吹打混勻十多次至沉淀分散，4℃，冰浴5 min 600 g離心5 min，棄去上清保留沉淀，得到的沉淀重復(fù)該操作一次，最后盡最大努力棄去上清保留沉淀。

（2）對(duì)于步驟4-(1)中獲得的沉淀加入100 μL細(xì)胞核蛋白抽提工作液，冰浴裂解30min，期間多次渦旋振蕩10-15s以充分裂解（核蛋白裂解后，如果條件允許建議使用超聲以大功率的提取核蛋白，增加蛋白質(zhì)的溶解度，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性，超聲3次，每次5秒，功率90w）。

（3）4℃ 12000g離心10 min收集上清為細(xì)胞核蛋白。抽提得到的漿核蛋白可立即使用，也可-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

實(shí)驗(yàn)案例分析

細(xì)胞刮收集A549，H1299，Hela三種細(xì)胞沉淀樣品，每種細(xì)胞約一個(gè)大皿的細(xì)胞量，按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行核漿蛋白的分離提取，得到的漿蛋白和核蛋白用于western blot分析，考察其核漿分離效果，結(jié)果如下圖所示：

圖3.三種細(xì)胞樣品的漿核蛋白western blot分析結(jié)果

注意事項(xiàng)

（1）需自備PMSF。PMSF母液用無(wú)水乙醇配制，臨用前2-3 min內(nèi)加入，以免在水溶液中很快失效；

（2）所有的抽提步驟都需要在冰上或者4℃進(jìn)行；

（3）本試劑盒只適用于細(xì)胞樣品漿核蛋白的提取分離，提取到的蛋白樣品可直接用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定；

（4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套；

（5）本產(chǎn)品僅作科研用途！